R语言学习笔记：从数据清洗到高级统计学和生物信息学 - 质控

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R语言学习笔记：从数据清洗到高级统计学和生物信息学 - 质控

https://djhcod.github.io/r-notes/single_cell/scRNA-seq_online/04_SC_quality_control.html

[Joy8Liu]

请问作者有想过用DoubletFinder等类似包进行双细胞识别和去除吗？或者请问对这一做法怎么看？是否有必要呢？

[djhcod]

感谢提问！

目前，我不会在初次质控时常规用 DoubletFinder 等包进行双细胞的识别和去除。

虽然目前已经开发出了众多用于双细胞识别的 R/python 包，例如DoubletFinder、scrublet、DoubletDecon，但是我发现在实际发表的文章中很多高分研究[1-3]没有在质控过程中使用这些工具，至少在我在的研究领域是这样。其中一个原因是双细胞检测是一个复杂的问题，这些工具仍然是基于模拟数据的算法，并不能适应不同的样本和测序环境并始终保持准确[4]。例如，对于一些处于中间分化状态的细胞，双细胞识别工具会导致假阳性的情况。第二，在大多数常规的单细胞测序中，双细胞大约只占到5%，通过设定UMI count和gene count的上限，也能够实现对明显的双细胞的去处。第三，Mary Piper 的单细胞教程以及部分高分文献[5]中，更倾向于在完成分群后再去判断哪些 cluster 可能是双细胞。常用的标准就是同时表达上皮/肿瘤标记基因(EPCAM)和免疫细胞标记基因(PTPRC)的 cluster。第四，在质控时一般首先尽可能放宽质量控制阈值，如果下游的聚类等环节出现无法解释的情况，则再重新进行更严格的质量控制。所以，我目前不会在初步质控中常规进行基于算法的双细胞识别。

如果你在自己的测序数据上决定要用上面的算法进行双细胞的去除，那么建议不要仅仅使用单一的算法（假阳性问题，如上所述）。可以参考 Regner 等[6]的思路，通过同时应用两种算法，如 DoubletDecon 和 DoubletFinder，只有当一个细胞被 DoubletDecon 和 DoubletFinder 同时标记为双细胞时才对其进行去除。最后，在使用这些算法之前，你需要仔细阅读作者的文档已了解使用的注意事项及使用范围，例如 DoubletFinder 的介绍文档中提到： DoubletFinder is sensitive to heterotypic doublets -- i.e., doublets formed from transcriptionally-distinct cell states -- but is insensitive to homotypic doublets.

参考文献：
[1] Hornburg M, Desbois M, Lu S, et al. Single-cell dissection of cellular components and interactions shaping the tumor immune phenotypes in ovarian cancer[J/OL]. Cancer Cell, 2021, 39(7): 928-944.e6. DOI:10.1016/j.ccell.2021.04.004.
[2] Izar B, Tirosh I, Stover E H, et al. A single-cell landscape of high-grade serous ovarian cancer[J/OL]. Nature Medicine, 2020, 26(8): 1271-1279. DOI:10.1038/s41591-020-0926-0.
[3] Xu J, Fang Y, Chen K, et al. Single-Cell RNA Sequencing Reveals the Tissue Architecture in Human High-Grade Serous Ovarian Cancer[J/OL]. Clinical Cancer Research, 2022, 28(16): 3590-3602. DOI:10.1158/1078-0432.CCR-22-0296.
[4] Andrews T S, Kiselev V Y, McCarthy D, et al. Tutorial: guidelines for the computational analysis of single-cell RNA sequencing data[J/OL]. Nature Protocols, 2021, 16(1): 1-9. DOI:10.1038/s41596-020-00409-w.
[5] Bill R, Wirapati P, Messemaker M, et al. CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers[J/OL]. Science, 2023, 381(6657): 515-524. DOI:10.1126/science.ade2292.
[6] Mj R, K W, S G R, et al. A multi-omic single-cell landscape of human gynecologic malignancies[J/OL]. Molecular cell, 2021, 81(23)[2024-04-10]. DOI:10.1016/j.molcel.2021.10.013.

[Joy8Liu]

感谢作者的详尽解答，对我非常有帮助，感谢~~😊

[Pineapple-wen6]

我们文章没有用双细胞检测工具是因为他们使用了nfeature nCount 比如nfeature小于等于8000，6000等较为严格的过滤，您这边是没有对数据设置上限的，本身双细胞的nfeature和ncount值是会比正常细胞高的